انواع محیط کشت

محیط کشت

۱-بلاد اگار :

اغلب نمونه های رسیده به آزمایشگاه میکروب شناسی بر روی محیط آگار خوندار کشت داده می‌شوند،
چون این محیط از رشد تمام واغلب باکتریهای سخت رشد حمایت کرده و اغلب میکروب شناسان عادت دارند
بر اساس مورفولوژی کلنی بر روی آگار خوندار تصمیم گیری نمایند .
این محیط از یک محیط پایه مانند تریپتون که منشاء پروتئینی دارد، کلرید سدیم آگار و ۵ درصد خون تشکیل شده است .

برخی باکتریها آنزیم های خارج سلولی تولیدکرده که بر روی گلبول‌های قرمز عمل کرده
و آنها راکاملاً لیز می‌کند (همولیزبتا ) یا یک تغییر سبز رنگ در اطراف کلنی ایجاد می‌کند ( همولیز ناقص یا آلفا ) در صورتی که برخی از باکتریها تغییری ایجاد نمی‌کنند( همولیزگاما) تولید همولیزین بوسیله باکتری به بسیاری از فاکتورهای محیطی مانند PH ، اکسیژن و دما بستگی دارد. میکروب شناسان اغلب از مورفولوژی کلنی و تولید همولیزین به عنوان آزمایشات غربالگری اولیه جهت کمک به تصمیم در انتخاب مراحل دیگر جهت شناسایی یک باکتری استفاده می‌کنند.

جهت مطالعه درست واکنش همولیتیک بر روی آگار خوندار، کارشناس بایستی پلیت را در مقابل نور گرفته و مشاهده نماید.
اگر از لوپ جهت کشت خطی بر روی آگار خوندار استفاده می‌شود باید آنرا در آگار فرو برده ( Stabbing) تا ارگانیسم بتواند در زیر سطح محیط که اکسیژن کمتری دارد رشدکند .

تولید همولیزین های حساس به اکسیژن در برخی از ارگانیسم ها بدین وسیله تشدید می‌گردد .
به روش دیگر، می‌توان پلیت‌ها را جهت مشاهده واکنش همولیزین حساس به اکسیژن به طریق بی هوازی نیز انکوبه نمود.

۲-محیط شکلات آگار(Chocolate agar):

شکلات آگار(Chocolate agar): این محیط در اصل بلاد آگار حرارت دیده است که در آن محیط پایه(بروسلا بیس آگار یا برین هارت اینفیوژن آگار…)  داغ می شود و خون را به این محیط  داغ اضافه می کنند که باعث تخریب گلبول های قرمز و  نشت مواد مغذی گلبول در محیط می شود.
به دلیل حرارت،  رنگ قرمز به قهوه ای(شکلاتی)  تغییر می کند.
این محیط به رنگ شکلات و کدر است.
این محیط  نسبت به بلاد آگار، به مراتب مغذی تر است و حتی باکتری هایی که در بلاد آگار رشد نمی کنند( مانند هموفیلوس انفلوانزا)در این محیط رشد می کنند که این به دلیل  دسترسی باکتری به طور مستقیم به مواد مغذی موجود در گلبول قرمز است..

۳-مانیتول سالت آگار(MSA) :

یک محیط انتخابی به منظور جداسازی استافیلوکوکهای بیماریزا ( کوآگولازمثبت) از نمونه هایی که حاوی باکتریهای متعدد هستند بکار می رود .

غلظت زیاد نمک ۵/۷% موجود در این محیط مانع از رشد کوکسیهای غیر بیماریزا می شود .
پس از کشت باید محیط را در ۳۷oC بمدت ۳۶ ساعت انکوبه کرد .
تخمیر قند مانیتول توسط باکتری مورد آزمایش ، بوسیله معرف فنل ـ رد موجود در محیط مشخص می‌گردد .
پس از انقضای مدت انکوباسیون ، استافیلوکوک های غیر بیماریزا بر روی این محیط ، کلنی های کوچک و سفید تشکیل می دهند که با هاله ای ارغوانی یا قرمز احاطه می شوند .
در حالیکه کلنی استافیلوکوکهای بیماریزا زرد رنگ بوده و هاله زرد رنگی نیز آنها را احاطه می کند .

طرز تهیه :

۱- محیط را پس از حل کردن در آب مقطر به کمک حرارت مرطوب به مدت ۱۵ دقیقه توسط اتوکلاو استریل نمایید .

۲- پس از آنکه دمای محیط به ۴۵-۵۰oc رسید ، آنرا در پلیت های استریل تقسیم نمائید . 

اگه قصد خرید محیط کشت دارید

از طریق این لینک اقدام کنید


۴-مک کانکی اگار :

مک کانکی آگار معمولترین محیط کشت انتخابی ـ افتراقی بوده ودارای رنگ کریستال ـ ویوله جهت ممانعت از رشد باکتریهای گرم ـ مثبت و اندیکاتور قرمز خنثی (Nautral red) جهت نشان دادن خصوصیات افتراقی می باشد .
با سیل های گرم ـ منفی به‌آسانی بر روی این محیط رشدنموده و باکتریهای تخمیر کننده لاکتوز ، محصولات اسیدی تولید نموده که سبب کاهش PH در محیط اطراف کلنی می گردد .
اندیکاتور قرمز خنثی در PH اسیدی قرمز رنگ می‌شود .
پس میکروارگانسیم های لاکتوز ـ منفی بی رنگ و شفاف مشاهده می شوند .
مک کانکی آگار محیط انتخابی و افتراقی مورد استفاده جهت گونه‌های شیگلا می باشد .

طرز تهیه محیط E.M.B و M.C مثل تهیه محیط نوترینت آگار می‌باشد .

  • باکتری های گرم منفی انتروباکتریاسه مانند اکلای و انتروباکتر ائروزنسلاکتوز را تخمیر می کنند .
  • اکلای کلنی های صورتی مایل به قرمز که گاهی در محیط با هاله ای قرمز رنگ در اطرافش مشخص میشود.
  • کلنی های انتروباکتر ائروزنس موکوئیدی صورتی مایل به قرمز هستند .
  • باکتری های گرم منفی پروتئوس ولگاریس و سالمونلا تیفیموریوم در محیط مک کانکی آگار رشد می کنند اما قند لاکتوز را تخمیر نمی کنند. در این حالت رنگ محیط کشت زرد و یا صورتی روشن است و 
    کلنی ها به صورت بیرنگ دیده می شوند و سوارمینگ از پروتئوس مهار شده است .

ترکیبات:

پپتون-لاکتوز-املاح صفراوی-آگار-قرمز خنثی یا بروموکرزول-آب مقطر

۵-محیط EMB (ائوزین متیلین بلو اگار) :

یک محیط افتراقی در بردارنده لاکتوز با پپتون وائوزین متیلن بلو است .
رنگهای انیلینی موجود در محیط ( ائوزین ، متیلن بلو ) مانع از رشد باکتریهای گرم ـ مثبت می شوند .

این رنگها همچنین در PH اسیدی باهم ترکیب شده وایجاد رسوب می نمایند .
بنابراین می توان از وجود آنها بعنوان شاخصی جهت تخمیر لاکتوز و تولید اسید نیز استفاده نمود .

باکتریها گرم ـ منفی بر اساس تخمیر یا عدم تخمیر قند لاکتوز کلنی های صورتی و یا بی رنگ تشکیل می دهند .

باکتری اشرشیا کلی ( E.coli ) که لاکتوز را بشدت تخمیر نموده و مقدار زیادی اسید تولید می نماید، بر روی این محیط دارای جلای فلزی سبزرنگ می باشد .

کلبسیلا، انتروباکتر، سراشیا که تخمیرکنندگان ضعیف لاکتوز هستند بر روی محیط کلنی های ارغوانی تولید می نمایند .

پروتئوس، سالمونلا، شیگلا که قادر به تخمیر لاکتوز نیستند بر روی این محیط کلنی های شفاف ایجاد می‌کنند ..

  • باکتری های گرم منفی انتروباکتریاسه مانند اکلای و انتروباکتر ائروزنسلاکتوز را تخمیر می کنند
  • کلونی های اکلای در محیط EMB دارای جلای فلزی سبز رنگ هستند
  • انتروباکتر ائروزنس در این محیط کلنی های صورتی رنگی ایجاد می کند که گاهی دارای نقاط بنفش در مرکز انها (چشم ماهی) هستند .
  • باکتری های گرم منفی پروتئوس ولگاریس و سالمونلا تیفیموریوم در محیط مک کانکی آگار رشد می کنند اما قند لاکتوز را تخمیر نمی کنند.
  • در ضمن در محیط EMB از قند ساکاروز هم برای تخمیر استفاده می شود .

 

۶٫محیط TSI )triple suger iron agar):

این محیط بطور گسترده در تشخیص باکتریهای روده‌ای ( اعضای خانواده انتروباکتریاسه ) کاربرد دارد.
که بصورت شیب دار در لوله آزمایش ساخته می شود و سطح بیشتری برای رشد باکتریها فراهم می‌آورد.
کشت در محیط جامد بصورت عمقی ‌ـ‌ سطحی می‌گیرد . 

محیط TSI حاوی معرف فنل ـ رد ، سولفات فرو ، تیو سولفات سدیم ( برای تشخیص تولید گاز سولفید هیدروژن ) و سه قند گلوگز ، لاکتوز و سوکروز است که غلظت گلوکز درمحیط ۱/۰ غلظت دو قند دیگر می باشد .

دامنه PH محیط از ۸/۶ تا ۴/۸ متغیر می باشد . این محیط قبل از کشت به دلیل داشتن معرف فنل ـ رد قرمز رنگ است .

با استفاده از TSI می توان سه خصوصیت را در یک باکتری مشخص نمود.

الف : توانایی تولید گاز CO2 , H2 از متابولیسم قندها .

ب : توانایی تولید مقادیر زیادی گاز سولفید هیدروژن که از طریق سیاه شدن محیط مشخص می شود .

( بی رنگ ) H2S تیوسولفات سدیم + محیط اسیدی ( باکتری ) 

(رسوب سیاه )FeS یون فریک + H2S 

ج : توانایی تخمیر گلوکز ، لاکتوز و سوکروز .

باسیلهای گرم ـ منفی را بر اساس واکنش ایجاد شده بر روی این محیط می‌توان به پنج گروه تقسیم کرد : 

در گروه I تخمیر گلوکز ، لاکتوز ، سوکروز ، منتهی به اسیدی شدن ( زرد شدن ) تمامی محیط و تولید گاز می‌گردد.

واکنش های ایجاد شده توسط باکتریهای گروه III,II همانند گروه I‌ است و تفاوت آنها فقط در تولید یا عدم تولید گاز است .

هنگامیکه عمق و سطح این محیط توسط باکتریهای گروه IV,III کشت داده می شود ، باکتری کشت داده شده ابتدا بطور هوازی و سپس بطریقه بی هوازی شروع به مصرف گلوکز می‌نماید . زمانی که هر دو طریقه در حال انجام است 

( ساعات اولیه انکوباسیون ) PH‌ تمامی نقاط محیط کشت اسیدی و در نتیجه محیط زرد رنگ است
اما از آنجایی که تخمیر هوازی در مقایسه با تخمیر بی هوازی با سرعت بیشتری بوقوع می‌پیوندد، گلوکز موجود در سطح به پایان رسیده و باکتریها شروع به تجزیه پپتون موجود در محیط می‌نمایند .
از تجزیه پپتون در شرایط هوازی ، بی هوازی آمونیاک (NH3 ) تولید می‌شود .
محصولات این عمل خاصیت قلیایی داشته و در نتیجه رنگ سطح محیط مجدداً قرمز می ‌شود .
درهمین حال عمق محیط بدلیل سیر‌آرامتر تخمیر بی هوازی گلوکز، همچنان اسیدی و زرد رنگ باقی می‌ماند .

گروه V یا سیلهای گرم ـ منفی غیر تخمیر کننده مانند گونه های سودوموناس، پپتونهای موجود در محیط را تجزیه کرده ودر سطح و عمق محیط را بدون تولید گاز، قرمز رنگ می‌نمایند .

مطالب ذکر شده را می توان بصورت زیر خلاصه نمود : 

گروه I سطح زرد / عمق زرد ، گاز مثبت ، H2S منفی. 

گروه II سطح زرد / عمق زرد ، گاز مثبت ، H2S مثبت. 

گروه III سطح قرمز / عمق زرد ، گاز مثبت ، H2S مثبت .

گروه IV سطح قرمز / عمق زرد ، گاز منفی ، H2S مثبت. 

گروه V سطح قرمز / عمق قرمز ، گاز منفی ، H2S منفی

۷-محیط(KIA):

این محیط افتراقی مشابه TSIمی باشد اما فاقد قند سوکروز می باشد و فقط قند گلوکز و لاکتوز را دارد.

۸-محیط سیمون سیترات آگار:

حاوی مقادیری نمک-الکترولیت ها-سیترات و معرف رنگی بروموتیمول بلو است.
اگر اورگانیسم توانایی مصرف سیترات و تبدیل ان به ترکیبات قلیایی استات و کربنات  را داشته باشد رنگ معرف محیط را از سبز به آبی تغییر می دهد اما در غیر این صورت محیط کشت به همان رنگ سبز باقی می ماند.

۹-محیط SIM:

با استفاده از این محیط سه خصوصیت مختلف باکتری را می توان سنجید و در تمام باکتری ها می توان بکار برد.
به طریقه Stab  تا یک سانتی متری انتهای لوله به وسیله آنس نوک تیز  در این محیط کشت می دهیم.

اساس آزمایش:
مواد اولیه تولید اندول یعنی اسید آمینه تریپتوفان در پپتونهای محیط موجود است.
هیدروژن سولفوره و سولفات نیز در محیط موجود است.
قوام نیمه جامد بودن محیط نیز اجازه پخش شدن و در نتیجه کدر نمودن محیط را به باکتری های متحرک می دهد.

ایجاد هیدروژن سولفوره توسط باکتری به صورت سیاه شدن محیط ظاهر می گردد و درصورت متحرک بودن باکتری کشت شده، سیاهی نیز تمام محیطی که باکتری پخش گردیده است ،انتشار می یابد .
سیاه شدن محصول واکنش هیدروزن سولفوره تولید شده با سولفات آهن و تشکیل رسوب سولفوره آهن سیاه رنگ می باشد.
با اضافه کردن یک میلی لیتر معرف کواکس  Covacs و یک میلی لیتر کلروفرم به کشت ۲۴ ساعته، ظهور رنگ ارغوانی در سطح کشت دلیل بر تولید ایندول توسط باکتری است .
باکتریهای که حاوی مجموعه آنزیمهایی که اصطلاحا تریپتوفاناز نامیده می گردند ،باشند قادرند طی سری واکنشهای شیمیایی تریپتوفان را اکسیده و اندول استیک تولید نمایند.

حرکت باکتری بواسطه پخش شدن آن از مسیر خط کشت به اطراف و کدر نمودن محیط مشخص می گردد.
باکتریهای فاقد حرکت تنها مسیر خط کشت را که نمایان است،کدر می کنند.
برای تعیین تولید اندول می توان از محیط تریپتوز نیز استفاده نمود.

روش آماده سازی معرف کواکس جهت تست اندول :                                     

فسفو دی متیل آمینو بنزآلدئید    ——————   ۵ گرم

ایزو آمیل الکل                      ——————-  ۷۵ میلی لیتر

اسید کلریدریک                   ——————-  ۲۵ میلی لیتر

آلدئید را در الکل به آرامی حل نموده واز بنماری ۵۵-۵۰ درجه سانتیگراد استفاده نموده و به آن اسید اضافه رده و دور از نور و در ۴ درجه سانتیگراد نگهداری می نماییم .
رنگ معرف باید از زرد روشن تا قهوهای روشن باشد. بعضی از نمونه ها آمیل الکل کافی نیست و با آلدئید رنگ سیاه می دهد.

۱۰-محیط کشت متیل رد وژوسپروسکار Methylred-Vegesproskaure broth (MR-VP)

این محیط ملاک آزمایشی می باشد برای تفکیک مسیرهای تخمیر گلوکز و نهایتا ایجاد ترکیبات اسیدهای آلی بوتاندیول یا بوتیلن گلایکول بوده که از این آزمایش در تفکیک و تشخیص کلی فرمها از هم مورد استفاده قرار می گیرد.
همچنین در تمایز بین استافیلوکوک و میکروکوک و گونه های آن  از این محیط استفاده می شود.

آزمایش  MR:

پس از انجام کشت و انکوباسیون ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت ۴۸ ساعت ، مقدار ۶/۰ میلی لیتر معرف رنگی متیل رد اضافه نموده و در صورت ظهور رنگ قرمز آزمایش MR مثبت می باشد.
در صورت پیدایش رنگ نارنجی آزمایش MR مثبت ضعیف می باشد و در صورت عدم تغییر و پایداری رنگ زرد آزمایش MR منفی می باشد.                                                                                                                                                                        

نتیجه:

ظهور رنگ قرمز———آزمایش مثبت  (PH=4/4)

        ظهور رنگ نارنجی——-آزمایش مثبت ضعیف(PH=5/3)

        ظهور رنگ زرد ———آزمایش منفی (PH=5/3)

طرز تهیه معرف MR:

۱-متیل رد    ——–  ۰۴/۰ گرم

۲-اتانول      ——– ۴۰ میلی لیتر

۳-|آب مقطر ——–  ۱۰۰ میلی لیتر

متیل رد را در اتانول حل نموده و به حجم ۱۰۰ میلی لیتر می رسانیم .

آزمایش VP:

به لوله کشت داده شده و انکوبه شده حدود۶/۰ میلی لیتر معرف آلفا نفتول (معرف A) و مقدار ۲/۰ میلی لیتر محلول پتاس (معرف B)  اضافه کرده و خوب تکان می دهیم.
اگر تغییر رنگ صورت نگرفت آنرا به مدت سی دقیقه به حال خود گذاشته و در صورتی که ظهور رنگ صورتی  تا قرمز پدیدار شود، آزمایش VP مثبت ،واگر تغییر رنگی صورت نپذیرد ، آزمایش VP منفی خواهد بود.

نتیجه:

مثبت=  ظهور رنگ صورتی تا قرمز

 منفی=  تغییر رنگی صورت نمی گیرد.

طرز تهیه معرف VP:

معرف A :

۱-آلفانفتول  ————-  ۵ گرم

۲-الکل اتلیک مطلق——-  ۱۰۰ میلی لیتر

محلول نباید تیره تر از رنگ کاه(نی) شود در صورت لزوم باید مجددا تقطیر گردد.

معرف B :                                                                             

۱-هیدروکسید پتاسیم —–  ۴۰ گرم

۲-آب مقطر  ————  ۱۰۰ میلی لیتر

۱۱-محیط کشت سلنیت  F براث  Selenite  F  broth

محیط مغذی است برای جدا سازی گونه های سالمونلاها .که یک محیط غنی کننده  Enrichment می باشد که حاوی سلنیت سدیم است که یک نمک صفراوی است و مانع از رشد باکتری های گرم مثبت و بسیاری از باکتری های گرم منفی میگردد.
میزان تکثیر سالمونلا در این محیط طی ۲۴-۱۲ ساعت اول از رشد هر یک از باکتریهای روده ای سریعتر است .
بنابر این کشت ثانوی باکتری  در محیطهای دیگر باید ظرف همان روز (۲۴-۱۲ ساعت) انجام گردد. 

باید توجه داشت این محیط در صورت ماندن و کهنه شدن خراب شده و رنگ آن به صورتی می گراید.
بنابر این هرچه کم رنگتر باشد ، تازه تر و برای کشت مناسبتر خواهد بود.

۱۲-محیط دی اکسی کولات (XLD):

ترکیبات:

پپتون-لاکتوز-سیترات سدیم-سیترات فریک-کلرو سدیم-فسفات دی پتاسیک-دی اکسی کلات سدیم-آگار-قرمز خنثی-آب مقطر

PHاین محیط حدود۷٫۲است.

این محیط برای شناسایی میکرواورگانیسم های جنس سالمونلا و جنس شیگلامورد استفاده قرار می گیرد.
این میکرواورگانیسم ها قادر به تخمیر لاکتوز نیستندو در روی این محیطها کلنی های بیرنگ تولید می کنند.
انواع دیگری از باکتری ها که قادر به مصرف لاکتوز نمی باشند در روی این محیط کشت رشد نمی کنند.

Hekton  Enteric agar-13

هکتون انتریک آگار محیطی انتخابی برای جداسازی و ترمیم نمونه های مدفوعی متعلق به باکتری های روده ای به ویژه سالمونلا و شیگلا است.
این محیط  باکتری های تخمیرکننده لاکتوز را از آنهایی که نمی توانند از تخمیر لاکتوز ، اسید تولید کنند با ایجاد رنگ زرد – نارنجی روی محیط مناسب در حضور شاخص pH متمایز می کند .
باکتری هایی که لاکتوز راتخمیر نمی کنند، روی محیط تغییر رنگ ایجاد نمی دهند.
هکتون انتریک آگارمی تواند تولید گاز هیدروژن سولفید را با تیره نمودن بخش هایی از محیط  نشان دهد.

۱۴-محیط سالمونلا ـ شیگلا (s.s) :

در محیط S.s ترکیباتی مانند پپتون ، لاکتوز ، املاح صفراوی ، نوترال رد، آگار، بریلین گرین ، تیو سولفات سدیم وجود دارد .
این محیط فقط اجازه رشد به باکتری های سالمونلا و شیگلا را می دهد .
بریلین گرین موجود در محیط مانع رشد باکتریهای گرم ـ مثبت و دیگر گرم منفی ها در محیط S.s می شود .
با استفاده از این محیط می‌توان سوشهای تخمیر کننده لاکتوز را از سوشهایی که توانایی تخمیر لاکتوز را ندارند، تشخیص داد .

سالمونلا ، شیگلا قادر به تخمیر لاکتوز نبوده، درمحیط S.s کلنی های بی رنگ ایجاد می کنند که ارزش تشخیصی دارد .

طرز تهیه :

برای ساخت این محیط مقدار مورد نیاز پودر S.s را در آب مقطر ریخته و به حجم می رسانید آنگاه بوسیله جوشاندن پودر را در آب مقطر کاملاً حل می‌کنید . این محیط احتیاج به اتوکلاو ندارد .

۱۵-محیط کشت آگار انتخابی ویبریو Vibrio selective agar) TCBS agar)

آگار تیو سولفات سیترات بایل ساکارز جهت جداسازی و کشت انتخابی ویبریوها بکار می رود.
غلظت بالای تیو سولفات و سیترات و قلیایی قوی این محیط رشد انتروباکتریاسه ها را تا حد زیادی متوقف می سازد.
هر باکتری که بتواند در این محیط رشد کند، قادر به متابولیزه کردن ساکارز نمی باشد.
فقط چند گونه ساکارز مثبت پروتئوس می توانند رشد نموده و کلنی های زرد مشابه ویبریو تولید نمایند.
اندیکاتور مخلوط تیمول بلو-بروموتیمول بلو با تشکیل اسید به رنگ زرد تغییر رنگ می دهد.(حتی با وجودی که درجه قلیائیت آن بالاست).

Mueller Hinton agar-16    

این محیط به عنوان یک محیط مغذی پایه برای بررسی آنتی بیوگرام مناسب است برای تهیه این محیط پس ازحل نمودن پودر دهیدراته محیط درآب مقطر و اتوکلاو نمودن , محیط را در پلیت های استریل تقسیم نمایید

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

طراحی سایت